科學家首次實現修正線粒體DNA突變，治愈不治之癥打開新大門

不圓 發(fā)自 凹非寺

量子位 | 公眾號 QbitAI

治愈不治之癥，又被向前推進了一公里：直接修改基因的那種。

發(fā)表在《PLOS Biology》（生物學top期刊）的最新研究顯示，荷蘭科學家成功糾正了線粒體DNA中的突變，在基因治療領域取得重大突破。

我們知道，線粒體基因突變會導致其功能障礙，進而引發(fā)與衰老相關的疾病、某些類型的癌癥以及嚴重且可能致命的母系遺傳線粒體疾病。

盡管CRISPR/Cas技術的開發(fā)為核DNA編碼的突變帶來了革命性的可能性，但該系統(tǒng)無法有效穿過線粒體膜并到達線粒體DNA，導致患有線粒體疾病的患者沒有治療的選擇。

而DdCBE（雙鏈DNA脫氨酶衍生的胞嘧啶堿基編輯器）解決了這個問題，能夠通過一種不依賴CRISPR/Cas的系統(tǒng)在線粒體基因組中進行編輯，精確改變線粒體DNA中的錯誤遺傳字母，無需切割DNA鏈。

該研究讓一些飽受疾病困擾的網友看到了治愈的希望。

在原代成人細胞中有效恢復線粒體功能

為探索DdCBE介導的線粒體DNA基因編輯的臨床應用潛力，論文的研究團隊在相關細胞類型中構建并功能校正了致病突變。

通過在人類成體肝臟類器官中引入致病性m.15150G>A突變，觀察到其對ATP生成的顯著影響；在Gitelman樣綜合征患者來源的成纖維細胞中成功校正m.4291T>C突變，可改善線粒體功能。

為推進DdCBE的臨床轉化，研究團隊采用目前最先進的非病毒基因遞送系統(tǒng)——脂質納米顆粒（LNPs）實現了修飾RNA（modRNA）編碼的線粒體堿基編輯器高效遞送。

該研究證實，DdCBE能在原代成人細胞中有效恢復線粒體功能。

在患者來源的類器官中構建m.15150G>A突變

在人類原代成人體肝干細胞來源的類器官中引入致病性線粒體突變，以MT-CYB基因中的m.15150G>A突變?yōu)槔@個無義突變可能會完全喪失細胞色素B蛋白的功能。

為了精確靶向DdCBE至m.15150G，研究團隊設計了兩組左端和右端TALEs，如下圖。

在HEK293T細胞中對所有四種左/右構建組合的驗證表明，每種組合在m.15150處的G→A編輯效率都很高。

編輯特異性由靶向編輯與旁觀者編輯的比率定義，結果表明使用R2構建組合的比率更高。

這些結果表明L1R2和L2R2是最佳組合，盡管效率更高的m.15150G>A無義突變可能掩蓋了下游旁觀者編輯的任何功能效應，因為m.15154C>T是一個沉默突變，而m.15155C>T是另一個無義突變。

出于一致性和旁觀者編輯可能效果較差的原因，研究團隊在進一步分析中繼續(xù)使用L1R1。

用L1R1編輯的HEK293T細胞中進行細胞色素B的Western blot，結果顯示細胞色素B蛋白水平降低。

隨后，研究團隊建立了一種通過電穿孔和FACS（流式細胞分選）共轉染GFP來選擇轉染的類器官細胞的線粒體編輯方案。

將電穿孔設備應用于類器官后，m.15150G>A的平均編輯效率為43%。

由于每個細胞含有數百到數千個mtDNA分子，因此編輯效率可能在單個細胞之間有顯著差異。為了解決這個問題，研究團隊采用單細胞方法來闡明DdCBE效率的內在變異性。

對單次FACS分選的類器官細胞衍生的克隆類器官進行測序顯示，編輯效率范圍在0%到80%。

兩次實驗的平均變異系數（VMR）為5.96，表明存在相對較高的離散度。

這些結果表明，DdCBE和類器官系的克隆生長可能是研究異質性對疾病機制影響的有用工具。

在患者來源的成纖維細胞中校正m.4291T>C突變

為了研究在原代細胞中糾正線粒體突變是否能恢復線粒體活性，研究團隊選擇了m.4291T>C突變。

該變異位于編碼線粒體異亮氨酸t(yī)RNA的MT-TI基因中，并影響反密碼子上游高度保守的尿嘧啶。

同樣的，研究團隊設計了兩組左、右TALEs來引導DdCBE至m.4291C，并在L2中引入一個不匹配但優(yōu)選的胸腺嘧啶末端重復可變二肽（RVD）。

用器官樣電穿孔方案處理成纖維細胞，并在FACS后以批量或單細胞方式接種細胞。

在同質化人類皮膚成纖維細胞上測試四種DNA構建體組合后發(fā)現，L2R2組合是恢復MT-TI突變的最高效編輯器。

為了比較單個成纖維細胞之間的基因校正效率，研究團隊從單個轉染的成纖維細胞中衍生出克隆系，揭示了單個成纖維細胞之間編輯效率的顯著差異。

與肝類器官類似，皮膚成纖維細胞的編輯效率離散度相當大（平均VMR：6.8）。

為了評估編輯后的mtDNA在細胞mtDNA庫中的穩(wěn)定性，研究團隊在培養(yǎng)超過50天后對編輯后的成纖維細胞（包括克隆和大量細胞系）進行測序。

有趣的是，在大多數成纖維細胞系中，m.4291T編輯的分數隨時間增加，這反映了編輯后的mtDNA沒有選擇劣勢。

另外，線粒體tRNA基因（如MT-TI）的突變已被報道會降低線粒體膜電位。因此，糾正m.4291T>C突變有望提高患者來源成纖維細胞的膜電位。

研究團隊使用圖像流式細胞術，分析了該突變在異質性水平背景下的功能效應。

TMRM染色檢測顯示，在突變校正率達76%和81%的成纖維細胞中，線粒體膜電位確實得到改善；而校正率僅為35%的細胞則未觀察到這一效應。

為進一步探究基因校正后線粒體的功能變化，研究團隊采用Seahorse能量代謝分析系統(tǒng)進行檢測。

結果顯示：在葡萄糖培養(yǎng)基中，校正后的成纖維細胞表現出基礎耗氧率（OCR）和ATP生成的適度提升；但在強制細胞依賴線粒體呼吸的半乳糖培養(yǎng)基中，這種改善并未出現。

然而，這些功能改善在不同實驗批次間未能保持一致性。

盡管m.4291T>C突變的校正恢復了線粒體膜電位，但OCR的功能改善并不穩(wěn)定，這表明在經校正的患者成纖維細胞中，線粒體功能恢復最多也只是適度水平。

基于modRNA和LNPs的線粒體堿基編輯

有效且安全的遞送方法對于DdCBE的治療應用至關重要。以modRNA形式包裹在LNPs中的、基于CRISPR的編輯工具，已經成功應用于多種體內模型。

為此，研究團隊將靶向m.15150G和m.4291C的DdCBE構建體制備為modRNA，以探究LNP遞送DdCBE modRNA在原代患者來源細胞中編輯mtDNA的潛力。

研究modRNA在類器官中用于m.15150G>A編輯的效果，與GFP構建體共轉染顯示，modRNA的轉染效率比DNA質粒高17倍。

即使在通過GFP-FACS篩選轉染細胞后，轉染后第6天，modRNA轉染類器官的mtBE效率在常規(guī)或雙倍劑量下仍比DNA轉染類器官高約4倍（圖3B）。

為研究使用modRNA對細胞死亡的影響，研究團隊通過電穿孔在DNA和RNA轉染后監(jiān)測細胞7天。

結果顯示，DNA轉染導致類器官的細胞死亡比modRNA轉染或無核苷酸對照至少高3倍，持續(xù)至少4天。

研究團隊還研究了modRNA在患者來源成纖維細胞中的校正效果，結果表明，轉染效率從DNA的13.1%提高到編碼DdCBE蛋白和GFP的modRNA的96.6%。

使用modRNA時，m.4291T>C校正的平均效率為59%。

這些結果表明，modRNA作為一種體外遞送工具，具有極大的潛力，能夠在保持活性的同時實現高效率。這對于難以維持和轉染的細胞可能特別有前景。

為驗證DdCBE與LNPs遞送系統(tǒng)的兼容性，研究團隊將靶向m.4291T>C的modRNA編碼DdCBE編輯系統(tǒng)與GFP-modRNA共同封裝于LNPs中。

用該制劑處理m.4291T>C突變成纖維細胞3天后，流式細胞檢測顯示：無論是單獨L2組件還是L2R2復合組件，其轉染效率均超過90%。

該遞送效率與商品化轉染試劑介導的modRNA脂質體轉染相當。

尤為關鍵的是，向12500個原代患者來源成纖維細胞遞送1μg LNP包裹的modRNA-DdCBE，可實現平均28%的編輯效率，充分展現了該技術在治療性基因編輯中的應用潛力。

經校正患者成纖維細胞的脫靶編輯分析

研究團隊還對基因校正后的成纖維細胞進行了脫靶編輯分析。

基于L2和R2-TALE靶序列的同源性，研究團隊篩選了核基因組中9個潛在的脫靶位點。通過NGS擴增子測序發(fā)現，這些位點間隔區(qū)內存在少量C?G→T?A堿基替換（最高占測序讀數的0.2%）。

然而，在三組獨立重復實驗中，這些替換在基因編輯組中的豐度均未顯著高于未校正的L2-only對照組，表明DdCBE-m.4291-L2R2堿基編輯器至少在這9個高同源性脫靶位點未產生顯著編輯活性。

進一步在線粒體基因組靶向擴增區(qū)內（超出間隔區(qū)范圍）檢測發(fā)現：MT-TQ基因中的m.4333和m.4354兩個位點，在至少一組L2R2重復實驗中出現>1%的C?G→T?A替換（較L2-only對照組高2倍以上），提示可能存在DdCBE-m.4291-L2R2介導的近端旁觀編輯。

但全基因組線粒體測序并未重復檢測到這些特異性替換，暗示其可能是NGS前PCR擴增引入的假象。

值得注意的是，研究團隊在L2R2處理組其他位點觀察到>1%的C?G→T?A脫靶編輯，且脫靶位點數量與靶向編輯效率呈正相關（三組重復實驗的脫靶位點數分別為40、0和6個，對應81%、18%和45%的靶向編輯效率）。

綜上所述，該論文的研究團隊在核基因組選定的9個序列依賴性脫靶位點中未檢測到脫靶編輯，而線粒體脫靶編輯似乎與靶向編輯相關，正如預期的那樣，盡管樣本量較小。

距離臨床還有數年時間

該研究表明，在原發(fā)性患者來源的成纖維細胞和人類成體肝臟干細胞衍生的類器官中，能夠高效實現線粒體DNA突變的創(chuàng)建與修正。

通過LNPs遞送DdCBE-modRNA成功校正患者成纖維細胞的m.4291T>C突變，證明了DdCBE與modRNA-LNPs遞送系統(tǒng)的兼容性。

雖然m.4291T>C突變的校正恢復了線粒體膜電位，但未顯著提升ATP產量或氧化呼吸功能，這一發(fā)現提示需要開展更深入的線粒體堿基編輯功能研究，包括評估線粒體脫靶編輯的影響。

經過數周培養(yǎng)，研究未發(fā)現校正后的線粒體DNA在群體或克隆群體中出現明顯丟失，表明編輯后的mtDNA保持穩(wěn)定且具有功能，至少對該特定突變而言，基因編輯不會隨時間推移產生選擇劣勢。

相反，可以觀察到所有克隆中編輯mtDNA比例均呈現輕微凈優(yōu)勢，這提示該校正方法具有長期有效性的潛力。

簡言之，DdCBE是一種有前景且精確的基因編輯工具，可用于在原代患者來源細胞類型中創(chuàng)建和糾正線粒體突變，并且與modRNA和LNP遞送具有良好的兼容性。

雖然臨床應用還有數年時間，但這項研究標志著朝著治療性編輯線粒體DNA邁出了巨大一步。

參考鏈接：
[1]https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3003207
[2]https://www.reddit.com/r/HotScienceNews/comments/1m1fxuo/scientists_just_edited_mitochondrial_dna/